La mutagénesis dirigida al sitio es un método de biología molecular que se utiliza para realizar cambios específicos e intencionales en la secuencia de ADN de un gen y cualquier producto génico . También llamada mutagénesis específica de sitio o mutagénesis dirigida por oligonucleótidos , se utiliza para investigar la estructura y actividad biológica de moléculas de ADN , ARN y proteínas , y para la ingeniería de proteínas .
La mutagénesis dirigida al sitio es una de las técnicas de laboratorio más importantes para crear bibliotecas de ADN mediante la introducción de mutaciones en secuencias de ADN. Hay numerosos métodos para lograr la mutagénesis dirigida al sitio, pero con la disminución de los costos de la síntesis de oligonucleótidos , la síntesis artificial de genes ahora se utiliza de vez en cuando como una alternativa a la mutagénesis dirigida al sitio. Desde 2013, el desarrollo de la CRISPR tecnología / Cas9, basado en un sistema de defensa viral procariota, también ha permitido la edición del genoma , y la mutagénesis puede ser realizada in vivo con relativa facilidad. [1]
Historia
Los primeros intentos de mutagénesis utilizando radiación o mutágenos químicos no fueron específicos del sitio, lo que generó mutaciones aleatorias. [2] Posteriormente se utilizaron análogos de nucleótidos y otras sustancias químicas para generar mutaciones puntuales localizadas , [3] ejemplos de dichas sustancias químicas son la aminopurina , [4] la nitrosoguanidina , [5] y el bisulfito . [6] La mutagénesis dirigida al sitio se logró en 1974 en el laboratorio de Charles Weissmann utilizando un análogo de nucleótido N 4 -hidroxicitidina, que induce la transición de GC a AT. [7] [8] Sin embargo, estos métodos de mutagénesis están limitados por el tipo de mutación que pueden lograr y no son tan específicos como los métodos posteriores de mutagénesis dirigida al sitio.
En 1971, Clyde Hutchison y Marshall Edgell demostraron que es posible producir mutantes con pequeños fragmentos del fago ϕX174 y nucleasas de restricción . [9] [10] Hutchison produjo más tarde con su colaborador Michael Smith en 1978 un enfoque más flexible para la mutagénesis dirigida al sitio mediante el uso de oligonucleótidos en un método de extensión de cebadores con ADN polimerasa. [11] Por su participación en el desarrollo de este proceso, Michael Smith más tarde compartió el Premio Nobel de Química en octubre de 1993 con Kary B. Mullis , quien inventó la reacción en cadena de la polimerasa .
Mecanismo basico
El procedimiento básico requiere la síntesis de un cebador de ADN corto. Este cebador sintético contiene la mutación deseada y es complementario del ADN molde alrededor del sitio de la mutación, por lo que puede hibridar con el ADN en el gen de interés. La mutación puede ser un único cambio de base (una mutación puntual ), múltiples cambios de base, deleción o inserción . El cebador de cadena simple se extiende entonces usando una ADN polimerasa , que copia el resto del gen. El gen así copiado contiene el sitio mutado, y luego se introduce en una célula huésped en un vector y se clonó . Por último, los mutantes son seleccionados por secuenciación del ADN para comprobar que contienen la mutación deseada.
Enfoques
El método original que usaba la extensión con un solo cebador era ineficaz debido a un bajo rendimiento de mutantes. Esta mezcla resultante contiene tanto la plantilla original no mutada como la hebra mutante, produciendo una población mixta de progenies mutantes y no mutantes. Además, la plantilla utilizada está metilada mientras que la hebra mutante no está metilada, y los mutantes pueden contraseleccionarse debido a la presencia de un sistema de reparación de errores de apareamiento que favorece la plantilla de ADN metilado, lo que da como resultado menos mutantes. Desde entonces se han desarrollado muchos enfoques para mejorar la eficacia de la mutagénesis.
Hay un gran número de métodos disponibles para efectuar la mutagénesis dirigida a un sitio, [12] aunque la mayoría de ellos rara vez se han utilizado en los laboratorios desde principios de la década de 2000, ya que las técnicas más nuevas permiten formas más simples y fáciles de introducir mutaciones específicas de un sitio en los genes.
El método de Kunkel
En 1985, Thomas Kunkel introdujo una técnica que reduce la necesidad de seleccionar mutantes. [13] El fragmento de ADN que se va a mutar se inserta en un fagémido como M13mp18 / 19 y luego se transforma en una cepa de E. coli deficiente en dos enzimas, dUTPasa ( dut ) y uracildesglicosidasa ( udg ). Ambas enzimas forman parte de una vía de reparación del ADN que protege al cromosoma bacteriano de mutaciones mediante la desaminación espontánea de dCTP a dUTP. La deficiencia de dUTPasa evita la descomposición de dUTP, lo que resulta en un alto nivel de dUTP en la célula. La deficiencia de uracilo deglicosidasa impide la eliminación de uracilo del ADN recién sintetizado. A medida que la E. coli doble mutante replica el ADN del fago, su maquinaria enzimática puede, por lo tanto, incorporar incorrectamente dUTP en lugar de dTTP, lo que da como resultado un ADN monocatenario que contiene algunos uracilos (ssUDNA). El ssUDNA se extrae del bacteriófago que se libera en el medio y luego se usa como molde para la mutagénesis. Se usa un oligonucleótido que contiene la mutación deseada para la extensión del cebador. El ADN heterodúplex, que se forma, consta de una hebra parental no mutada que contiene dUTP y una hebra mutada que contiene dTTP. A continuación, el ADN se transforma en una cepa de E. coli que lleva los genes dut y udg de tipo salvaje . Aquí, la hebra de ADN parental que contiene uracilo se degrada, de modo que casi todo el ADN resultante consiste en la hebra mutada.
Mutagénesis casete
A diferencia de otros métodos, la mutagénesis de casete no necesita implicar la extensión del cebador utilizando ADN polimerasa. En este método, se sintetiza un fragmento de ADN y luego se inserta en un plásmido. [14] Implica la escisión por una enzima de restricción en un sitio del plásmido y la ligación posterior de un par de oligonucleótidos complementarios que contienen la mutación en el gen de interés para el plásmido. Normalmente, las enzimas de restricción que cortan el plásmido y el oligonucleótido son las mismas, lo que permite que los extremos pegajosos del plásmido y el inserto se liguen entre sí. Este método puede generar mutantes con una eficacia cercana al 100%, pero está limitado por la disponibilidad de sitios de restricción adecuados que flanquean el sitio que se va a mutar.
Mutagénesis dirigida al sitio de PCR
La limitación de los sitios de restricción en la mutagénesis de casete puede superarse usando la reacción en cadena de la polimerasa con " cebadores " de oligonucleótidos , de modo que se pueda generar un fragmento más grande, que cubra dos sitios de restricción convenientes. La amplificación exponencial en PCR produce un fragmento que contiene la mutación deseada en cantidad suficiente para ser separado del plásmido original no mutado por electroforesis en gel , que luego puede insertarse en el contexto original usando técnicas estándar de biología molecular recombinante. Hay muchas variaciones de la misma técnica. El método más simple coloca el sitio de mutación hacia uno de los extremos del fragmento por lo que uno de los dos oligonucleótidos usados para generar el fragmento contiene la mutación. Esto implica un solo paso de PCR, pero todavía tiene el problema inherente de requerir un sitio de restricción adecuado cerca del sitio de mutación a menos que se use un cebador muy largo. Otras variaciones, por lo tanto, emplean tres o cuatro oligonucleótidos, dos de los cuales pueden ser oligonucleótidos no mutagénicos que cubren dos sitios de restricción convenientes y generan un fragmento que puede ser digerido y ligado en un plásmido, mientras que el oligonucleótido mutagénico puede ser complementario a una ubicación. dentro de ese fragmento muy lejos de cualquier sitio de restricción conveniente. Estos métodos requieren múltiples pasos de PCR para que el fragmento final a ligar pueda contener la mutación deseada. El proceso de diseño para generar un fragmento con la mutación deseada y los sitios de restricción relevantes puede ser engorroso. Las herramientas de software como SDM-Assist [15] pueden simplificar el proceso.
Mutagénesis de plásmido completo
Para las manipulaciones de plásmidos, otras técnicas de mutagénesis dirigida al sitio han sido reemplazadas en gran parte por técnicas que son altamente eficientes pero relativamente simples, fáciles de usar y disponibles comercialmente como un kit. Un ejemplo de estas técnicas es el método Quikchange, [16] en el que se utilizan un par de cebadores mutagénicos complementarios para amplificar el plásmido completo en una reacción de termociclado utilizando una ADN polimerasa de alta fidelidad sin desplazamiento de cadena como la pfu polimerasa . La reacción genera un ADN circular mellado . El ADN molde debe eliminarse mediante digestión enzimática con una enzima de restricción como Dpn I, que es específica del ADN metilado. Todo el ADN producido a partir de la mayoría de las cepas de Escherichia coli estaría metilado; el plásmido molde que se biosintetiza en E. coli , por lo tanto, será digerido, mientras que el plásmido mutado, que se genera in vitro y, por lo tanto, no está metilado, quedaría sin digerir. Tenga en cuenta que, en estos métodos de mutagénesis de plásmidos de doble hebra, aunque se puede utilizar la reacción de termociclado, no es necesario que el ADN se amplifique exponencialmente como en una PCR. En cambio, la amplificación es lineal y, por lo tanto, es inexacto describirlos como una PCR, ya que no hay reacción en cadena.
Tenga en cuenta que la pfu polimerasa puede desplazar la hebra a una temperatura de extensión más alta (≥70 ° C), lo que puede provocar el fracaso del experimento, por lo que la reacción de extensión debe realizarse a la temperatura recomendada de 68 ° C. En algunas aplicaciones, se ha observado que este método conduce a la inserción de múltiples copias de cebadores. [17] Una variación de este método, llamada SPRINP, previene este artefacto y se ha utilizado en diferentes tipos de mutagénesis dirigida al sitio. [17]
Otras técnicas, como la mutagénesis de exploración de dianas dirigidas por oligonucleótidos (SMOOT), pueden combinar oligonucleótidos mutagénicos de forma semi-aleatoria en la mutagénesis de plásmidos. [18] Esta técnica puede crear bibliotecas de mutagénesis de plásmidos que van desde mutaciones únicas hasta mutagénesis de codones completa en un gen completo.
Métodos de mutagénesis dirigida al sitio in vivo
- Delitto perfetto [19]
- Desplazamiento "pop-in pop-out"
- Deleción directa de genes y mutagénesis específica de sitio con PCR y un marcador reciclable
- Deleción directa de genes y mutagénesis específica de sitio con PCR y un marcador reciclable usando regiones homólogas largas
- Mutagénesis dirigida al sitio in vivo con oligonucleótidos sintéticos [20]
CRISPR
Desde 2013, el desarrollo de la tecnología CRISPR -Cas9 ha permitido la introducción eficiente de diversas mutaciones en el genoma de una amplia variedad de organismos. El método no requiere un sitio de inserción de transposones, no deja marcadores y su eficiencia y simplicidad lo han convertido en el método preferido para la edición del genoma . [21] [22]
Aplicaciones
La mutagénesis dirigida al sitio se usa para generar mutaciones que pueden producir una proteína diseñada racionalmente que tiene propiedades mejoradas o especiales (es decir, ingeniería de proteínas).
Herramientas de investigación : las mutaciones específicas del ADN permiten investigar la función y las propiedades de una secuencia de ADN o de una proteína con un enfoque racional. Además, los cambios de un solo aminoácido por mutagénesis dirigida al sitio en proteínas pueden ayudar a comprender la importancia de las modificaciones postraduccionales. Por ejemplo, cambiar una serina particular (fosfoaceptor) a una alanina (fosfo-no aceptor) en una proteína sustrato bloquea la unión de un grupo fosfato, por lo que permite investigar la fosforilación. Este enfoque se ha utilizado para descubrir la fosforilación de la proteína CBP por la quinasa HIPK2 [23]. Otro enfoque integral es la mutagénesis de saturación de sitios donde un codón o un conjunto de codones pueden sustituirse por todos los aminoácidos posibles en las posiciones específicas. [24]
Aplicaciones comerciales : las proteínas pueden diseñarse para producir formas mutantes que se adapten a una aplicación específica. Por ejemplo, los detergentes para ropa de uso común pueden contener subtilisina , cuya forma de tipo salvaje tiene una metionina que puede oxidarse con lejía, reduciendo significativamente la actividad de la proteína en el proceso. [25] Esta metionina puede ser reemplazada por alanina u otros residuos, haciéndola resistente a la oxidación, manteniendo activa la proteína en presencia de lejía. [26]
Síntesis de genes
A medida que disminuye el costo de la síntesis de oligonucleótidos de ADN, la síntesis artificial de un gen completo es ahora un método viable para introducir mutaciones en el gen. Este método permite una mutagénesis extensa en múltiples sitios, incluido el rediseño completo del uso de codones del gen para optimizarlo para un organismo en particular. [27]
Ver también
- Mutagénesis dirigida
- Análisis del valor de phi
Referencias
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enlaces externos
- Conferencia Nobel sobre la invención de la mutagénesis dirigida al sitio
- OpenWetWare
- Diagrama que resume la mutagénesis dirigida al sitio