Mutagénesis dirigida al sitio
La mutagénesis dirigida al sitio es un método de biología molecular que se utiliza para realizar cambios de mutación específicos e intencionales en la secuencia de ADN de un gen y cualquier producto génico . También llamada mutagénesis específica de sitio o mutagénesis dirigida por oligonucleótidos , se utiliza para investigar la estructura y la actividad biológica de las moléculas de ADN , ARN y proteínas , y para la ingeniería de proteínas .
La mutagénesis dirigida al sitio es una de las técnicas de laboratorio más importantes para crear bibliotecas de ADN mediante la introducción de mutaciones en las secuencias de ADN. Existen numerosos métodos para lograr la mutagénesis dirigida al sitio, pero con la disminución de los costos de la síntesis de oligonucleótidos , la síntesis de genes artificiales ahora se usa ocasionalmente como una alternativa a la mutagénesis dirigida al sitio. Desde 2013, el desarrollo de la tecnología CRISPR /Cas9, basada en un sistema de defensa viral procariótico, también ha permitido editar el genoma , y la mutagénesis se puede realizar in vivo con relativa facilidad. [1]
Los primeros intentos de mutagénesis utilizando radiación o mutágenos químicos no eran específicos del sitio y generaban mutaciones aleatorias. [2] Los análogos de nucleótidos y otras sustancias químicas se usaron más tarde para generar mutaciones puntuales localizadas , [3] ejemplos de tales sustancias químicas son la aminopurina , [4] la nitrosoguanidina , [5] y el bisulfito . [6] La mutagénesis dirigida al sitio se logró en 1974 en el laboratorio de Charles Weissmann utilizando un análogo de nucleótido N 4 -hidroxicitidina, que induce la transición de GC a AT. [7] [8]Estos métodos de mutagénesis, sin embargo, están limitados por el tipo de mutación que pueden lograr y no son tan específicos como los métodos posteriores de mutagénesis dirigida al sitio.
En 1971, Clyde Hutchison y Marshall Edgell demostraron que es posible producir mutantes con pequeños fragmentos del fago ϕX174 y nucleasas de restricción . [9] [10] Más tarde, Hutchison produjo con su colaborador Michael Smith en 1978 un enfoque más flexible para la mutagénesis dirigida al sitio mediante el uso de oligonucleótidos en un método de extensión de cebadores con ADN polimerasa. [11] Por su parte en el desarrollo de este proceso, Michael Smith más tarde compartió el Premio Nobel de Química en octubre de 1993 con Kary B. Mullis , quien inventó la reacción en cadena de la polimerasa .
El procedimiento básico requiere la síntesis de un cebador de ADN corto. Este cebador sintético contiene la mutación deseada y es complementario al ADN molde que rodea el sitio de la mutación, por lo que puede hibridarse con el ADN del gen de interés. La mutación puede ser un cambio de una sola base (una mutación puntual ), cambios de múltiples bases, deleción o inserción . El cebador monocatenario luego se extiende usando una ADN polimerasa , que copia el resto del gen. El gen así copiado contiene el sitio mutado y luego se introduce en una célula huésped en un vector y se clona . Finalmente, los mutantes se seleccionan mediante secuenciación de ADN .para comprobar que contienen la mutación deseada.
El método original que usaba la extensión de un solo cebador era ineficaz debido al bajo rendimiento de mutantes. Esta mezcla resultante contiene tanto la plantilla original no mutada como la hebra mutante, produciendo una población mixta de progenies mutantes y no mutantes. Además, la plantilla utilizada está metilada mientras que la hebra mutante no está metilada, y los mutantes pueden contraseleccionarse debido a la presencia de un sistema de reparación de desajustes que favorece la plantilla de ADN metilada, lo que da como resultado menos mutantes. Desde entonces, se han desarrollado muchos enfoques para mejorar la eficacia de la mutagénesis.
