La versatilidad de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) ha dado lugar a una gran cantidad de variantes de PCR .
Modificaciones basicas
A menudo, solo es necesario realizar una pequeña modificación en el protocolo de PCR estándar para lograr un objetivo deseado:
Multiplex-PCR utiliza varios pares de cebadores que se hibridan con diferentes secuencias diana. Esto permite el análisis simultáneo de múltiples objetivos en una sola muestra. Por ejemplo, en las pruebas de mutaciones genéticas, se pueden combinar seis o más amplificaciones. En el protocolo estándar para la toma de huellas dactilares de ADN , las dianas analizadas a menudo se amplifican en grupos de 3 o 4. La amplificación de sonda dependiente de la ligadura múltiple (o MLPA ) permite la amplificación de múltiples dianas utilizando un solo par de cebadores, evitando las limitaciones de resolución de PCR multiplex. La PCR multiplex también se ha utilizado para el análisis de microsatélites y SNP . [1]
Número variable de repeticiones en tándem (VNTR) La PCR se dirige a áreas del genoma que presentan variación de longitud . El análisis de los genotipos de la muestra suele implicar el dimensionamiento de los productos de amplificación mediante electroforesis en gel . El análisis de segmentos VNTR más pequeños conocidos como repeticiones cortas en tándem (o STR) es la base para las bases de datos de huellas dactilares de ADN como CODIS .
La PCR asimétrica amplifica preferentemente una hebra del ADN diana. Se utiliza en algunos métodos de secuenciación y sondeo de hibridación para generar una hebra de ADN como producto. El termociclado se realiza como en la PCR, pero con una cantidad limitante o dejando fuera uno de los cebadores. Cuando el cebador limitante se agota, la replicación aumenta aritméticamente a través de la extensión del cebador en exceso. [2] Una modificación de este proceso, denominada L inear- A fter- T he- E xponential-PCR (o LATE-PCR ), utiliza un cebador limitante con una temperatura de fusión más alta (T m ) que el cebador en exceso para mantener la reacción eficiencia ya que la concentración de cebador limitante disminuye a mitad de la reacción. [3] (Ver también PCR de superposición-extensión ).
Se necesitan algunas modificaciones para realizar una PCR larga . El proceso de PCR original basado en Klenow no generó productos que fueran mayores de aproximadamente 400 pb. Sin embargo, la polimerasa Taq puede amplificar objetivos de hasta varios miles de pb de longitud. [4] Desde entonces, los protocolos modificados con la enzima Taq han permitido amplificar objetivos de más de 50 kb. [5]
La PCR anidada se utiliza para aumentar la especificidad de la amplificación del ADN. Se utilizan dos conjuntos de cebadores en dos reacciones sucesivas. En la primera PCR, se usa un par de cebadores para generar productos de ADN, que pueden contener productos amplificados de áreas no objetivo. Los productos de la primera PCR se usan luego como molde en una segunda PCR, usando uno ('hemi-anidamiento') o dos cebadores diferentes cuyos sitios de unión están ubicados (anidados) dentro del primer conjunto, aumentando así la especificidad. La PCR anidada suele tener más éxito en la amplificación específica de productos de ADN largos que la PCR convencional, pero requiere un conocimiento más detallado de la secuencia de la diana.
La PCR cuantitativa se utiliza para medir la cantidad específica de ADN (o ARN) diana en una muestra. Al medir la amplificación solo dentro de la fase de verdadero aumento exponencial, la cantidad de producto medido refleja con mayor precisión la cantidad inicial de objetivo. Se utilizan termocicladores especiales que controlan la cantidad de producto durante la amplificación. Los métodos de PCR cuantitativa en tiempo real (QRT-PCR) utilizan tintes fluorescentes, como Sybr Green, o sondas de ADN que contienen fluoróforos , como TaqMan , para medir la cantidad de producto amplificado a medida que avanza la amplificación.
La PCR de inicio en caliente es una técnica que se realiza manualmente calentando los componentes de la reacción a la temperatura de fusión del ADN (por ejemplo, 95 ° C) antes de agregar la polimerasa. De esta forma, se evita la amplificación inespecífica a temperaturas más bajas. [6] Alternativamente, los reactivos especializados inhiben la actividad de la polimerasa a temperatura ambiente, ya sea por la unión de un anticuerpo o por la presencia de inhibidores unidos covalentemente que solo se disocian después de un paso de activación a alta temperatura. La 'PCR de inicio en caliente / acabado en frío' se logra con nuevas polimerasas híbridas que están inactivas a temperatura ambiente y solo se activan a temperaturas elevadas.
En la PCR de toma de contacto , la temperatura de recocido disminuye gradualmente en ciclos posteriores. La temperatura de recocido en los primeros ciclos suele ser de 3 a 5 ° C por encima de la T m estándar de los cebadores utilizados, mientras que en los ciclos posteriores es una cantidad similar por debajo de la T m . La temperatura de hibridación inicial más alta conduce a una mayor especificidad para la unión del cebador, mientras que las temperaturas más bajas permiten una amplificación más eficiente al final de la reacción. [7]
La PCR de ensamblaje (también conocida como ensamblaje de ciclo de polimerasa o PCA ) es la síntesis de estructuras de ADN largas mediante la realización de PCR en un grupo de oligonucleótidos largos con segmentos cortos superpuestos, para ensamblar dos o más piezas de ADN en una sola pieza. Implica una PCR inicial con cebadores que se superponen y una segunda PCR utilizando los productos como plantilla que genera el producto final de longitud completa. Esta técnica puede sustituir alensamblaje basado en ligadura . [8]
En la PCR de colonias, las colonias bacterianas se seleccionan directamente mediante PCR, por ejemplo, la detección de construcciones de vector de ADN correctas . Se toman muestras de las colonias con una punta de pipeta estéril y se transfiere una pequeña cantidad de células a una mezcla de PCR. Para liberar el ADN de las células, la PCR se inicia con un tiempo prolongado a 95 ° C (cuando se usa polimerasa estándar) o con un paso de desnaturalización acortado a 100 ° C y ADN polimerasa quimérica especial. [9]
La reacción en cadena de la polimerasa digital amplifica simultáneamente miles de muestras, cada una en una gota separada dentro de una emulsión.
La PCR suicida se utiliza normalmente en paleogenética u otros estudios en los que evitar falsos positivos y garantizar la especificidad del fragmento amplificado es la máxima prioridad. Originalmente se describió en un estudio para verificar la presencia del microbio Yersinia pestis en muestras dentales obtenidas de tumbas del siglo XIV de personas supuestamente muertas por peste durante la epidemia medieval de peste negra. [10] El método prescribe el uso de cualquier combinación de cebadores solo una vez en una PCR (de ahí el término "suicidio"), que nunca debería haberse utilizado en ninguna reacción de PCR de control positivo, y los cebadores siempre deberían apuntar a una región genómica nunca amplificada antes en el laboratorio utilizando este o cualquier otro conjunto de cebadores. Esto asegura que no haya ADN contaminante de reacciones de PCR anteriores en el laboratorio, lo que de otro modo podría generar falsos positivos.
COLD-PCR ( co -amplification en l ower d enaturation temperatura-PCR) es un protocolo modificado que enriquece variante alelos de una mezcla de tipo salvaje y el ADN que contiene la mutación.
Pretratamientos y extensiones
El proceso básico de PCR a veces puede preceder o seguir a otra técnica.
RT-PCR (o R Everse T ranscription PCR ) se utiliza para y amplificar-transcribir inversa de ARN a ADNc . La PCR está precedida por una reacción que utiliza la transcriptasa inversa , una enzima que convierte el ARN en ADNc. Las dos reacciones pueden combinarse en un tubo, y el paso de calentamiento inicial de la PCR se utiliza para inactivar la transcriptasa. [4] La polimerasa Tth (descrita a continuación) tiene actividad RT y puede llevar a cabo toda la reacción. La RT-PCR se usa ampliamente en el perfil de expresión , que detecta la expresión de un gen. También se puede utilizar para obtener la secuencia de una transcripción de ARN, que puede ayudar a determinar lossitios de inicio y terminaciónde la transcripción (mediante RACE-PCR ) y facilitar el mapeo de la ubicación de exones e intrones en una secuencia de genes.
La PCR de dos colas utiliza un cebador único que se une a un objetivo de microARN con extremos 3 'y 5', conocidos como hemiprobos. [11] Ambos extremos deben ser complementarios para que se produzca la unión. Luego, el extremo 3 'se extiende mediante transcriptasa inversa formando un ADNc largo. A continuación, el ADNc se amplifica utilizando dos cebadores de PCR específicos de la diana. La combinación de dos hemiprobos, ambos dirigidos al objetivo de microARN corto, hace que el ensayo de dos colas sea extremadamente sensible y específico.
La PCR mediada por ligación utiliza pequeños "enlazadores" (o adaptadores) de oligonucleótidos de ADN que primero se ligan a fragmentos del ADN diana. Los cebadores de PCR que se hibridan con las secuencias enlazadoras se utilizan luego para amplificar los fragmentos diana. Este método se implementa para la secuenciación de ADN, el recorrido del genoma y la huella de ADN . [12] Una técnica relacionada es el polimorfismo de longitud de fragmento amplificado , que genera fragmentos de diagnóstico de un genoma.
La PCR específica de metilación ( MSP ) se utiliza para identificar patrones de metilación del ADN en islas de citosina-guanina (CpG) en el ADN genómico. [13] El ADN objetivo se trata primero con bisulfito de sodio , que convierte las bases de citosina no metiladas en uracilo , que es complementario de la adenosina en los cebadores de PCR. A continuación, se llevan a cabo dos amplificaciones en el ADN tratado con bisulfito: un conjunto de cebadores se hibrida con el ADN con citosinas (correspondiente a la citosina metilada) y el otro conjunto se hibrida con el ADN con uracilo (que se corresponde con la citosina no metilada). La MSP utilizada en la PCR cuantitativa proporciona información cuantitativa sobre el estado de metilación de una isla CpG determinada. [14]
Otras modificaciones
Los ajustes de los componentes en la PCR se utilizan comúnmente para un rendimiento óptimo.
El ion magnesio divalente (Mg ++ ) es necesario para la actividad de la polimerasa de PCR. Las concentraciones más bajas de Mg ++ aumentarán la fidelidad de la replicación, mientras que las concentraciones más altas introducirán más mutaciones. [15]
Los desnaturalizantes (como DMSO ) pueden aumentar la especificidad de amplificación desestabilizando la unión del cebador no específico. Otros productos químicos, como el glicerol , son estabilizadores de la actividad de la polimerasa durante la amplificación. Los detergentes (como Triton X-100 ) pueden evitar que la polimerasa se adhiera a sí misma oa las paredes del tubo de reacción.
Las ADN polimerasas incorporan ocasionalmente bases erróneas en la hebra que se extiende. La PCR de alta fidelidad emplea enzimas con actividad exonucleasa 3'-5 ' que disminuye esta tasa de incorporación errónea. Ejemplos de enzimas con actividad de corrección de pruebas incluyen Pfu ; Los ajustes de las concentraciones de Mg ++ y dNTP pueden ayudar a maximizar la cantidad de productos que coinciden exactamente con el ADN objetivo original. [ cita requerida ]
Modificaciones de cebadores
Los ajustes a los oligonucleótidos sintéticos utilizados como cebadores en la PCR son una rica fuente de modificación:
Normalmente, los cebadores de PCR se eligen de una parte invariante del genoma y podrían usarse para amplificar un área polimórfica entre ellos. En la PCR específica de alelos se hace lo contrario. Al menos uno de los cebadores se elige de un área polimórfica, con las mutaciones ubicadas en (o cerca) de su extremo 3 '. En condiciones rigurosas, un cebador no emparejado no iniciará la replicación, mientras que un cebador emparejado lo hará. Por tanto, la aparición de un producto de amplificación indica el genotipo. (Para obtener más información, consulte Genotipado de SNP ).
La PCR InterSequence-Specific (o ISSR-PCR ) es un método para la toma de huellas dactilares de ADN que utiliza cebadores seleccionados de segmentos repetidos en un genoma para producir una huella dactilar única de longitudes de producto amplificadas. [16] El uso de cebadores de un segmento comúnmente repetido se llama Alu-PCR y puede ayudar a amplificar secuencias adyacentes (o entre) estas repeticiones.
Los cebadores también pueden diseñarse para ser 'degenerados', capaces de iniciar la replicación desde una gran cantidad de ubicaciones objetivo. La amplificación del genoma completo (o WGA ) es un grupo de procedimientos que permiten que la amplificación se produzca en muchos lugares de un genoma desconocido y que puede que solo esté disponible en pequeñas cantidades. Otras técnicas usan cebadores degenerados que se sintetizan usando múltiples nucleótidos en posiciones particulares (la polimerasa 'elige' los cebadores correctamente emparejados). Además, los cebadores se pueden sintetizar con el análogo de nucleósido inosina , que se hibrida con tres de las cuatro bases normales. Una técnica similar puede obligar a la PCR a realizar mutagénesis dirigida al sitio . (ver también reacción en cadena de la polimerasa de extensión superpuesta )
Normalmente, los cebadores utilizados en la PCR están diseñados para ser completamente complementarios a la diana. Sin embargo, la polimerasa es tolerante a emparejamientos incorrectos lejos del extremo 3 '. Los cebadores de cola incluyen secuencias no complementarias en sus extremos 5 '. Un procedimiento común es el uso de cebadores-enlazadores , que finalmente colocan sitios de restricción en los extremos de los productos de PCR, lo que facilita su posterior inserción en vectores de clonación.
Una extensión del método 'colony-PCR' (arriba), es el uso de cebadores de vectores . Los fragmentos de ADN diana (o ADNc) se insertan primero en un vector de clonación y se diseña un único conjunto de cebadores para las áreas del vector que flanquean el sitio de inserción. La amplificación ocurre para cualquier ADN que se haya insertado. [4]
La PCR se puede modificar fácilmente para producir un producto marcado para su uso posterior como sonda de hibridación . Se pueden usar uno o ambos cebadores en la PCR con un marcador radiactivo o fluorescente ya adherido, o se pueden añadir marcadores después de la amplificación. Estos métodos de marcado se pueden combinar con "PCR asimétrica" (arriba) para producir sondas de hibridación eficaces.
La PCR dependiente de RNasa H (rhPCR) puede reducir la formación de dímeros de cebadores y aumentar el número de ensayos en la PCR multiplex. El método utiliza cebadores con un bloque escindible en el extremo 3 'que se elimina mediante la acción de una enzima RNasa HII termoestable. [17]
ADN polimerasas
Hay varias ADN polimerasas que se utilizan en la PCR.
El fragmento de Klenow , derivado de la ADN polimerasa I original de E. coli , fue la primera enzima utilizada en la PCR. Debido a su falta de estabilidad a altas temperaturas, debe reponerse durante cada ciclo y, por lo tanto, no se usa comúnmente en la PCR.
La ADN polimerasa del bacteriófago T4 (familia A) también se utilizó inicialmente en la PCR. Tiene una mayor fidelidad de replicación que el fragmento de Klenow, pero también se destruye con el calor. La ADN polimerasa T7 (familia B) tiene propiedades y propósitos similares. Se ha aplicado a la mutagénesis dirigida al sitio [18] y la secuenciación de Sanger . [19]
La polimerasa Taq , la ADN polimerasa I de Thermus aquaticus , fue la primera polimerasa termoestable utilizada en la PCR, y sigue siendo la más utilizada. La enzima puede aislarse de su fuente nativa o de su gen clonado expresado en E. coli . [4] Un 61 kDa truncado por carecer de actividad exonucleasa 5'-3 'se conoce como fragmento Stoffel y se expresa en E. coli . [20] La falta de actividad exonucleasa puede permitirle amplificar objetivos más largos que la enzima nativa. Se ha comercializado como AmpliTaq y Klentaq . [21] También se ha producido una variante diseñada para la PCR de inicio en caliente denominada "polimerasa de inicio rápido". Requiere una fuerte activación por calor, evitando así la amplificación inespecífica debido a la actividad de la polimerasa a baja temperatura. Se han creado muchas otras variantes . [22]
Otras polimerasas Thermus , como la polimerasa Tth I ( P52028 ) de Thermus thermophilus , han tenido algún uso. Tth tiene actividad de transcriptasa inversa en presencia de iones Mn 2+ , lo que permite la amplificación por PCR a partir de objetivos de ARN. [23]
El género arcaico Pyrococcus ha demostrado ser una rica fuente de polimerasas termoestables con actividad de corrección de pruebas. La ADN polimerasa de Pfu , aislada de P. furiosus muestra una disminución de 5 veces en la tasa de error de replicación en comparación con Taq. [24] Dado que los errores aumentan a medida que avanza la PCR, la Pfu es la polimerasa preferida cuando los productos deben clonarse individualmente para su secuenciación o expresión. Otras polimerasas menos utilizadas de este género incluyen Pwo ( P61876 ) de Pyrococcus woesei , Pfx de una especie sin nombre, polimerasa "Deep Vent" ( Q51334 ) de la cepa GB-D. [25]
La polimerasa Vent o Tli es una ADN polimerasa extremadamente termoestable aislada de Thermococcus litoralis . También se ha comercializado la polimerasa de Thermococcus fumicolans ( Tfu ). [25]
Modificaciones del mecanismo
A veces, incluso se puede modificar el mecanismo básico de la PCR.
A diferencia de la PCR normal, la PCR inversa permite la amplificación y secuenciación del ADN que rodea una secuencia conocida. Implica someter inicialmente el ADN diana a una serie de digestiones con enzimas de restricción y luego circularizar los fragmentos resultantes mediante autoligado . Los cebadores están diseñados para extenderse hacia afuera del segmento conocido, lo que resulta en la amplificación del resto del círculo. Esto es especialmente útil para identificar secuencias a ambos lados de varios insertos genómicos. [26]
De manera similar, la PCR entrelazada asimétrica térmica (o TAIL-PCR ) se usa para aislar secuencias desconocidas que flanquean un área conocida del genoma. Dentro de la secuencia conocida, TAIL-PCR utiliza un par anidado de cebadores con diferentes temperaturas de hibridación. Se utiliza un cebador "degenerado" para amplificar en la otra dirección de la secuencia desconocida. [27]
Métodos de amplificación isotérmica
Se han desarrollado algunos protocolos de amplificación de ADN que pueden utilizarse de forma alternativa a la PCR. Son isotérmicos, lo que significa que funcionan a temperatura constante. [28]
La amplificación dependiente de helicasa (HDA) es similar a la PCR tradicional, pero utiliza una temperatura constante en lugar de realizar ciclos a través de los pasos de desnaturalización y recocido / extensión. La ADN helicasa , una enzima que desenrolla el ADN, se usa en lugar de la desnaturalización térmica. [29] La amplificación isotérmica mediada por bucle es una idea similar, pero realizada con una polimerasa de desplazamiento de hebra. [30]
La reacción de amplificación de la enzima de corte (NEAR) y su amplificación por desplazamiento de hebra prima(SDA) son isotermas, replican el ADN a una temperatura constante utilizando una polimerasa y una enzima de corte. [28]
Recombinase Polymerase Amplification (RPA) [31] utiliza una recombinasa para emparejar específicamente cebadores con ADN bicatenario sobre la base de la homología, dirigiendo así la síntesis de ADN a partir de secuencias definidas de ADN presentes en la muestra. La presencia de la secuencia diana inicia la amplificación del ADN y no se requiere fusión térmica o química del ADN. La reacción progresa rápidamente y da como resultado una amplificación específica del ADN desde unas pocas copias diana hasta niveles detectables, por lo general en 5 a 10 minutos. Todo el sistema de reacción es estable como formulación seca y no necesita refrigeración. La RPA se puede utilizar para reemplazar la PCR en una variedad de aplicaciones de laboratorio y los usuarios pueden diseñar sus propios ensayos. [32]
Otros tipos de amplificación isotérmica incluyen la amplificación del genoma completo (WGA), la amplificación basada en la secuencia de ácidos nucleicos (NASBA) y la amplificación mediada por transcripción (TMA). [28]
Ver también
- PCR de Vectorette
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enlaces externos
- Manual de aplicaciones de PCR (de Roche Diagnostics).
- La referencia en qPCR: una plataforma de información académica e industrial
- www.eConferences.de portal de transmisión: amplíe sus conocimientos en qPCR, dPCR y NGS.