Los análogos de ácidos nucleicos son compuestos que son análogos (estructuralmente similares) al ARN y al ADN naturales , utilizados en medicina y en investigación de biología molecular. Los ácidos nucleicos son cadenas de nucleótidos, que se componen de tres partes: un esqueleto de fosfato , un azúcar pentosa, ya sea ribosa o desoxirribosa , y una de cuatro bases nucleicas . Un análogo puede tener cualquiera de estos alterados. [1]Normalmente, las nucleobases análogas confieren, entre otras cosas, diferentes propiedades de apareamiento y apilamiento de bases. Los ejemplos incluyen bases universales, que pueden emparejarse con las cuatro bases canónicas, y análogos de la cadena principal de fosfato-azúcar como el PNA , que afectan las propiedades de la cadena (el PNA puede incluso formar una triple hélice ). [2] Los análogos de ácido nucleico también se denominan ácido xeno nucleico y representan uno de los pilares principales de la xenobiología , el diseño de formas de vida nuevas para la naturaleza basadas en bioquímicas alternativas.
Los ácidos nucleicos artificiales incluyen ácido nucleico peptídico (PNA), morfolino y ácido nucleico bloqueado (LNA), así como ácido nucleico glicol (GNA), ácido nucleico treosa (TNA) y ácidos nucleicos hexitol (HNA). Cada uno de estos se distingue del ADN o ARN de origen natural por cambios en la columna vertebral de la molécula.
En mayo de 2014, los investigadores anunciaron que habían introducido con éxito dos nuevos nucleótidos artificiales en el ADN bacteriano y, al incluir nucleótidos artificiales individuales en los medios de cultivo, pudieron pasar las bacterias 24 veces; no crearon ARNm ni proteínas capaces de utilizar los nucleótidos artificiales. Los nucleótidos artificiales presentaban 2 anillos aromáticos fusionados.
Medicamento
Se utilizan varios análogos de nucleósidos como agentes antivirales o anticancerosos. La polimerasa viral incorpora estos compuestos con bases no canónicas. Estos compuestos se activan en las células al convertirse en nucleótidos, se administran como nucleósidos ya que los nucleótidos cargados no pueden atravesar fácilmente las membranas celulares.
Biología Molecular
Los análogos de ácidos nucleicos se utilizan en biología molecular para varios propósitos: Investigación de posibles escenarios del origen de la vida: Al probar diferentes análogos, los investigadores intentan responder a la pregunta de si el uso de ADN y ARN en la vida se seleccionó a lo largo del tiempo debido a sus ventajas. o si fueron elegidos por casualidad arbitraria; [3] Como herramienta para detectar secuencias particulares: XNA puede usarse para etiquetar e identificar una amplia gama de componentes de ADN y ARN con alta especificidad y precisión; [4] Como enzima que actúa sobre sustratos de ADN, ARN y XNA, se ha demostrado que XNA tiene la capacidad de escindir y ligar ADN, ARN y otras moléculas de XNA similares a las acciones de las ribozimas de ARN ; [3] Como herramienta con resistencia a la hidrólisis de ARN ; Investigación de los mecanismos utilizados por la enzima; Investigación de las características estructurales de los ácidos nucleicos.
Análogos de la columna vertebral
Análogos de ARN resistentes a la hidrólisis
Para superar el hecho de que el grupo hidroxi 2 'de la ribosa que reacciona con el grupo hidroxi 3' unido a fosfato (el ARN es demasiado inestable para ser utilizado o sintetizado de forma fiable), se utiliza un análogo de la ribosa. Los análogos de ARN más comunes son ARN 2'-O-metil-sustituido, ácido nucleico bloqueado (LNA) o ácido nucleico puenteado (BNA), morfolino , [5] [6] y ácido nucleico peptídico ( PNA ). Aunque estos oligonucleótidos tienen un azúcar principal diferente o, en el caso del PNA, un residuo de aminoácido en lugar de la ribosa fosfato, todavía se unen al ARN o al ADN según el emparejamiento de Watson y Crick, pero son inmunes a la actividad nucleasa. No pueden sintetizarse enzimáticamente y solo pueden obtenerse sintéticamente usando la estrategia de fosforamidita o, para el PNA, métodos de síntesis de péptidos .
Otros análogos notables utilizados como herramientas.
Los didesoxinucleótidos se utilizan en la secuenciación . Estos nucleósidos trifosfatos poseen un azúcar no canónico, didesoxirribosa, que carece del grupo hidroxilo 3 'normalmente presente en el ADN y, por lo tanto, no puede unirse a la siguiente base. La falta del grupo hidroxilo 3 'termina la reacción en cadena ya que las ADN polimerasas lo confunden con un desoxirribonucleótido regular. Otro análogo de terminación de cadena que carece de un hidroxilo 3 'e imita a la adenosina se llama cordicepina . Cordycepin es un medicamento contra el cáncer que se dirige a la replicación del ARN . Otro análogo en la secuenciación es un análogo de nucleobase, 7-deaza-GTP y se usa para secuenciar regiones ricas en CG, en lugar de 7-deaza-ATP se llama tubercidina , un antibiótico.
Precursores del mundo del ARN
ARN puede ser demasiado complejo para ser el primer ácido nucleico, por lo que antes de que el mundo del ARN varios ácidos nucleicos más simples que difieren en la columna vertebral, tales como TNA y GNA y PNA , se han ofrecido como candidatos para los primeros ácidos nucleicos.
Análogos de base
Estructura y nomenclatura de nucleobase
Las bases de origen natural se pueden dividir en dos clases según su estructura:
- las pirimidinas son heterocíclicas de seis miembros con átomos de nitrógeno en la posición 1 y 3.
- las purinas son bicíclicas y consisten en una pirimidina fusionada a un anillo de imidazol.
Se han insertado nucleótidos artificiales ( pares de bases no naturales (UBP) denominados d5SICS UBP y dNaM UBP ) en el ADN bacteriano, pero estos genes no moldearon el ARNm ni indujeron la síntesis de proteínas. Los nucleótidos artificiales presentaban dos anillos aromáticos fusionados que formaban un complejo (d5SICS-dNaM) que imitaba el par de bases naturales (dG-dC). [7] [8] [9]
Mutágenos
Uno de los análogos de bases más comunes es el 5-bromouracilo (5BU), la base anormal que se encuentra en el análogo de nucleótidos mutagénico BrdU. Cuando se incorpora al ADN un nucleótido que contiene 5-bromouracilo, es más probable que se empareje con la adenina; sin embargo, puede cambiar espontáneamente a otro isómero que se empareja con una nucleobase diferente , la guanina . Si esto sucede durante la replicación del ADN, se insertará una guanina como el análogo de base opuesto, y en la siguiente replicación del ADN, esa guanina se emparejará con una citosina. Esto da como resultado un cambio en un par de bases de ADN, específicamente una mutación de transición .
Además, el HNO2 o ácido nitroso es un potente mutágeno que actúa sobre el ADN replicante y no replicante. Puede provocar la desaminación de los grupos amino de adenina, guanina y citosina. La adenina se desamina a hipoxantina , cuyas bases forman citosina en lugar de timina. La citosina se desamina a uracilo, cuya base se empareja con adenina en lugar de guanina. La desaminación de guanina no es mutagénica. Las mutaciones inducidas por ácido nitroso también se inducen a mutar de nuevo a tipo salvaje utilizando ácido nitroso.
Fluoróforos
Comúnmente, los fluoróforos (como la rodamina o la fluoresceína ) están unidos al anillo unido al azúcar (en para) a través de un brazo flexible, presumiblemente saliendo del surco principal de la hélice. Debido a la baja procesividad de los nucleótidos ligados a aductos voluminosos como los floróforos por las polimerasas taq, la secuencia se copia típicamente usando un nucleótido con un brazo y luego se acopla con un fluoróforo reactivo (marcaje indirecto):
- reactivo con amina: el nucleótido de aminoalilo contiene un grupo amina primaria en un enlazador que reacciona con el tinte reactivo con amino, como una cianina o tintes Alexa Fluor , que contienen un grupo saliente reactivo, como un éster de succinimidilo (NHS). (los grupos amino de emparejamiento de bases no se ven afectados).
- tiol reactivo: los nucleótidos que contienen tiol reaccionan con el fluoróforo unido a un grupo saliente reactivo, como una maleimida.
- Los nucleótidos unidos a biotina se basan en el mismo principio de marcaje indirecto (+ estreptavidina fluorescente) y se utilizan en los chips de ADN Affymetrix .
Los fluoróforos encuentran una variedad de usos en medicina y bioquímica.
Análogos de base fluorescente
El análogo de base fluorescente más comúnmente utilizado y disponible comercialmente, 2-aminopurina (2-AP), tiene un alto rendimiento cuántico de fluorescencia libre en solución (0,68) que se reduce considerablemente (aproximadamente 100 veces pero muy dependiente de la secuencia de bases) cuando incorporado en los ácidos nucleicos. [10] La sensibilidad de emisión de 2-AP al entorno inmediato es compartida por otros análogos de base fluorescentes prometedores y útiles como 3-MI, 6-MI, 6-MAP, [11] pyrrolo-dC (también disponible comercialmente), [12 ] derivados modificados y mejorados de pirrolo-dC, [13] bases modificadas con furano [14] y muchas otras (ver revisiones recientes). [15] [16] [17] [18] [19] Esta sensibilidad al microambiente se ha utilizado en estudios de, por ejemplo, estructura y dinámica dentro del ADN y ARN, dinámica y cinética de la interacción ADN-proteína y transferencia de electrones dentro del ADN. Un grupo muy interesante y recientemente desarrollado de análogos de bases fluorescentes que tiene un rendimiento cuántico de fluorescencia que es casi insensible a su entorno inmediato es la familia de las citosinas tricíclicas. La 1,3-diaza-2-oxofenotiazina, tC, tiene un rendimiento cuántico de fluorescencia de aproximadamente 0,2 tanto en hebras simples como dobles, independientemente de las bases circundantes. [20] [21] También el oxo-homólogo de tC llamado tC O (ambos disponibles comercialmente), 1,3-diaza-2-oxofenoxazina, tiene un rendimiento cuántico de 0,2 en sistemas de doble hebra. [22] Sin embargo, es algo sensible a las bases circundantes en hebras simples (rendimientos cuánticos de 0,14 a 0,41). Los rendimientos cuánticos altos y estables de estos análogos de bases los hacen muy brillantes y, en combinación con sus buenas propiedades de análogos de bases (deja la estructura y la estabilidad del ADN casi intactas), son especialmente útiles en la anisotropía de fluorescencia y las mediciones de FRET, áreas donde otros los análogos de base fluorescente son menos precisos. Además, en la misma familia de análogos de citosina , se ha desarrollado un análogo de base aceptor de FRET, tC nitro . [23] Junto con tC O como donante de FRET, esto constituye el primer par de FRET análogo de base de ácido nucleico jamás desarrollado. La familia tC, por ejemplo, se ha utilizado en estudios relacionados con los mecanismos de polimerasa de unión al ADN y de polimerización del ADN.
Bases naturales no canónicas
En una célula, hay varias bases no canónicas presentes: islas CpG en el ADN (a menudo están metiladas), todas las ARNm eucariotas (cubiertas con una metil-7-guanosina) y varias bases de ARNr (están metiladas). A menudo, los ARNt se modifican fuertemente postranscripcionalmente para mejorar su conformación o emparejamiento de bases, en particular en / cerca del anticodón: la inosina puede emparejar bases con C, U e incluso con A, mientras que la tiouridina (con A) es más específica que el uracilo. (con una purina). [24] Otras modificaciones comunes de la base del ARNt son pseudouridina (que da nombre al bucle TΨC), dihidrouridina (que no se apila porque no es aromática), queuosina, wyosina, etc. Sin embargo, todas estas son modificaciones de bases normales y no son colocadas por una polimerasa. [24]
Emparejamiento de bases
Las bases canónicas pueden tener un grupo carbonilo o amina en los carbonos que rodean el átomo de nitrógeno más alejado del enlace glicosídico, lo que les permite un par de bases ( emparejamiento de bases Watson-Crick) a través de enlaces de hidrógeno (amina con cetona, purina con pirimidina) . La adenina y la 2-aminoadenina tienen uno o dos grupos amina, mientras que la timina tiene dos grupos carbonilo, y la citosina y la guanina son una mezcla de amina y carbonilo (invertidos entre sí).
Pares de bases naturales | |
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Un par de bases GC: purina carbonilo / amina forma tres enlaces de hidrógeno intermoleculares con pirimidina amina / carbonilo | Un par de bases AT: amina purina / - forma dos enlaces de hidrógeno intermoleculares con pirimidina carbonilo / carbonilo |
Se debate la razón precisa por la que solo hay cuatro nucleótidos, pero hay varias posibilidades no utilizadas. Además, la adenina no es la opción más estable para el emparejamiento de bases: en Cyanophage S-2L se usa diaminopurina (DAP) en lugar de adenina ( evasión del huésped ). [25] La diaminopurina se empareja perfectamente con la timina, ya que es idéntica a la adenina pero tiene un grupo amina en la posición 2 que forma 3 enlaces de hidrógeno intramoleculares, eliminando la principal diferencia entre los dos tipos de pares de bases (Débil: AT y Fuerte: CG). Esta estabilidad mejorada afecta las interacciones de unión a proteínas que se basan en esas diferencias. Otra combinación incluye,
- isoguanina e isocitosina, que tienen sus amina y cetona invertidas en comparación con la guanina y la citosina estándar (probablemente no se usan ya que los tautómeros son problemáticos para el emparejamiento de bases, pero isoC e isoG se pueden amplificar correctamente con PCR incluso en presencia de las 4 bases canónicas) [26]
- diaminopirimidina y una xantina, que se unen como 2-aminoadenina y timina pero con estructuras invertidas (no se usa ya que la xantina es un producto de desaminación)
Arreglos de pares de bases no utilizados | ||
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Una base DAP-T: purina amina / amina forma tres enlaces de hidrógeno intermoleculares con pirimidina cetona / cetona | Una base X-DAP: purina cetona / cetona forma tres enlaces de hidrógeno intermoleculares con pirimidina amina / amina | Una base iG-iC: purina amina / cetona forma tres enlaces de hidrógeno intermoleculares con pirimidina cetona / amina |
Sin embargo, se puede formar la estructura correcta del ADN incluso cuando las bases no están emparejadas mediante enlaces de hidrógeno; es decir, las bases se emparejan gracias a la hidrofobicidad, como han demostrado estudios utilizando isósteros de ADN (análogos con el mismo número de átomos), como el análogo de timina 2,4-difluorotolueno (F) o el análogo de adenina 4-metilbencimidazol (Z). [27] Un par hidrófobo alternativo podría ser la isoquinolina y la pirrolo [2,3-b] piridina [28]
Otros pares de bases destacables:
- También se han elaborado varias bases fluorescentes, tales como el par de bases 2-amino-6- (2-tienil) purina y pirrol-2-carbaldehído. [29]
- Bases coordinadas con metales, como el emparejamiento entre un piridina-2,6-dicarboxilato (ligando tridentado) y una piridina (ligando monodentado) a través de la coordinación plana cuadrada con un ión de cobre central. [30]
- Las bases universales pueden emparejarse indiscriminadamente con cualquier otra base, pero, en general, reducen considerablemente la temperatura de fusión de la secuencia; los ejemplos incluyen derivados de 2'-desoxiinosina (desoxinucleótido de hipoxantina), análogos de nitroazol y bases hidrófobas aromáticas sin enlaces de hidrógeno (fuertes efectos de apilamiento). Estos se utilizan como prueba de concepto y, en general, no se utilizan en cebadores degenerados (que son una mezcla de cebadores).
- El número de posibles pares de bases se duplica cuando se considera xDNA . El xDNA contiene bases expandidas, en las que se ha agregado un anillo de benceno, que puede emparejarse con bases canónicas, lo que da como resultado cuatro posibles pares de bases (8 bases: xA-T, xT-A, xC-G, xG-C, 16 bases si se utilizan los arreglos no utilizados). Otra forma de base añadida al benceno es el yDNA, en el que el benceno ensancha la base. [31]
Nuevos pares de bases con propiedades especiales | ||
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Una base FZ: el metilbencimidazol no forma enlaces de hidrógeno intermoleculares con el tolueno F / F | Una base S-Pa: la purina tienil / amina forma tres enlaces de hidrógeno intermoleculares con pirrol - / carbaldehído | Una base xA-T: la misma unión que AT |
Pares de bases de metal
En el emparejamiento de bases metálicas, los enlaces de hidrógeno de Watson-Crick se reemplazan por la interacción entre un ión metálico con nucleósidos que actúan como ligandos. Las posibles geometrías del metal que permitirían la formación de dúplex con dos nucleósidos bidentados alrededor de un átomo metálico central son: tetraédrica , dodecaédrica y cuadrada plana . La formación de complejos de metales con el ADN puede ocurrir mediante la formación de pares de bases no canónicos a partir de nucleobases naturales con participación de iones metálicos y también mediante el intercambio de los átomos de hidrógeno que forman parte del emparejamiento de bases Watson-Crick por iones metálicos. [32] La introducción de iones metálicos en un dúplex de ADN ha demostrado tener propiedades conductoras [33] magnéticas potenciales , [34] así como una mayor estabilidad. [35]
Se ha demostrado que se producen complejos metálicos entre bases nucleicas naturales . Un ejemplo bien documentado es la formación de T-Hg-T, que implica dos nucleobases de timina desprotonadas que se unen mediante Hg 2+ y forman un par de metal-base conectado. [36] Este motivo no se adapta al Hg 2+ apilado en un dúplex debido a un proceso de formación de horquilla dentro de la hebra que se favorece sobre la formación de dúplex. [37] Dos timinas frente a frente en un dúplex no forman un par de bases Watson-Crick en un dúplex; este es un ejemplo en el que un desajuste de pares de bases Watson-Crick se estabiliza mediante la formación del par metal-base. Otro ejemplo de un metal que forma complejos con nucleobases naturales es la formación de A-Zn-T y G-Zn-C a pH alto; Co +2 y Ni +2 también forman estos complejos. Estos son pares de bases de Watson-Crick donde el catión divalente se coordina con las nucleobases. Se debate la encuadernación exacta. [38]
Se ha desarrollado una gran variedad de nucleobases artificiales para su uso como pares de bases metálicas. Estas nucleobases modificadas exhiben propiedades electrónicas sintonizables, tamaños y afinidades de unión que pueden optimizarse para un metal específico. Por ejemplo, se ha demostrado que un nucleósido modificado con un 2,6-dicarboxilato de piridina se une estrechamente a Cu 2+ , mientras que otros iones divalentes sólo se unen de forma débil. El carácter tridentado contribuye a esta selectividad. El cuarto sitio de coordinación en el cobre está saturado por una nucleobase de piridina dispuesta de manera opuesta. [39] El sistema de emparejamiento de bases metálicas asimétricas es ortogonal a los pares de bases de Watson-Crick. Otro ejemplo de una nucleobase artificial es aquella con nucleobases de hidroxipiridona, que son capaces de unir Cu 2+ dentro del dúplex de ADN. Se incorporaron cinco pares de bases de cobre-hidroxipiridona consecutivos en una doble hebra, que estaban flanqueados por una sola base nucleotídica natural en ambos extremos. Los datos de EPR mostraron que la distancia entre los centros de cobre se estimó en 3,7 ± 0,1 Å, mientras que un dúplex de ADN de tipo B natural es solo un poco más grande (3,4 Å). [40] El atractivo para apilar iones metálicos dentro de un dúplex de ADN es la esperanza de obtener alambres metálicos autoensamblables nanoscópicos, aunque esto aún no se ha realizado.
Par de bases no naturales (UBP)
Un par de bases no naturales (UBP) es una subunidad diseñada (o nucleobase ) de ADN que se crea en un laboratorio y no ocurre en la naturaleza. En 2012, un grupo de científicos estadounidenses dirigido por Floyd Romesberg, biólogo químico del Instituto de Investigación Scripps en San Diego, California, publicó que su equipo diseñó un par de bases no naturales (UBP). [41] Los dos nuevos nucleótidos artificiales o pares de bases no naturales (UBP) se denominaron d5SICS y dNaM . Más técnicamente, estos nucleótidos artificiales que llevan nucleobases hidrófobas , presentan dos anillos aromáticos fusionados que forman un complejo (d5SICS – dNaM) o un par de bases en el ADN. [9] [42] En 2014, el mismo equipo del Instituto de Investigación Scripps informó que sintetizaron un tramo de ADN circular conocido como un plásmido que contiene pares de bases TA y CG naturales junto con el laboratorio de UBP de mejor rendimiento que Romesberg había diseñado e insertado en células de la bacteria común E. coli que replicaron con éxito los pares de bases no naturales a través de múltiples generaciones. [43] Este es el primer ejemplo conocido de un organismo vivo que transmite un código genético ampliado a las generaciones posteriores. [9] [44] Esto se logró en parte mediante la adición de un gen de algas de apoyo que expresa un transportador de nucleótidos trifosfato que importa eficientemente los trifosfatos de d5SICSTP y dNaMTP en la bacteria E. coli . [9] Luego, las vías de replicación bacteriana natural las usan para replicar con precisión el plásmido que contiene d5SICS – dNaM.
La incorporación exitosa de un tercer par de bases es un avance significativo hacia el objetivo de expandir en gran medida el número de aminoácidos que pueden ser codificados por el ADN, de los 20 aminoácidos existentes a 172 teóricamente posibles, expandiendo así el potencial de los organismos vivos para producir nuevas proteínas . [43] Anteriormente, las cadenas artificiales de ADN no codificaban nada, pero los científicos especularon que podrían diseñarse para fabricar nuevas proteínas que podrían tener usos industriales o farmacéuticos. [45] La transcripción de ADN que contiene pares de bases no naturales y la traducción del ARNm correspondiente se lograron recientemente. En noviembre de 2017, el mismo equipo del Instituto de Investigación Scripps que introdujo por primera vez dos nucleobases adicionales en el ADN bacteriano, informó haber construido una bacteria E. coli semisintética capaz de producir proteínas utilizando dicho ADN. Su ADN contenía seis nucleobases diferentes : cuatro canónicas y dos añadidas artificialmente, dNaM y dTPT3 (estas dos forman un par). Además, esta bacteria tenía dos bases de ARN adicionales correspondientes incluidas en dos nuevos codones, ARNt adicionales que reconocen estos nuevos codones (estos ARNt también contienen dos nuevas bases de ARN dentro de sus anticodones) y aminoácidos adicionales, lo que hace que las bacterias puedan sintetizar proteínas "no naturales". . [46] [47]
Otra demostración de UBP fue realizada por el grupo de Ichiro Hirao en el instituto RIKEN en Japón. En 2002, desarrollaron un par de bases no naturales entre 2-amino-8- (2-tienil) purina (s) y piridina-2-ona (y) que funciona in vitro en la transcripción y traducción, para la incorporación de sitio específico de aminoácidos no estándar en proteínas. [48] En 2006, crearon 7- (2-tienil) imidazo [4,5-b] piridina (Ds) y pirrol-2-carbaldehído (Pa) como un tercer par de bases para la replicación y la transcripción. [49] Posteriormente, Ds y 4- [3- (6-aminohexanamido) -1-propinil] -2-nitropirrol (Px) se descubrió como un par de alta fidelidad en la amplificación por PCR. [50] [51] En 2013, aplicaron el par Ds-Px a la generación de aptámeros de ADN mediante selección in vitro (SELEX) y demostraron que la expansión del alfabeto genético aumentaba significativamente las afinidades de los aptámeros de ADN por las proteínas diana. [52]
Sistema ortogonal
Se ha propuesto y estudiado la posibilidad, tanto teórica como experimentalmente, de implementar un sistema ortogonal en el interior de las células independiente del material genético celular para hacer un sistema completamente seguro [53], con el posible aumento de los potenciales de codificación. [54] Varios grupos se han centrado en diferentes aspectos:
- nuevos esqueletos y pares de bases como se discutió anteriormente
- Polimerasas artificiales de replicación / transcripción XNA ( Xeno Nucleic Acid ) que comienzan generalmente a partir de la ARN polimerasa T7 [55]
- ribosomas ( secuencias 16S con secuencia anti Shine-Dalgarno alterada que permite la traducción de solo ARNm ortogonal con una secuencia Shine-Dalgarno alterada coincidente) [56]
- ARNt novedoso que codifica aminoácidos no naturales. Ver código genético ampliado
Ver también
- Biotina
- Apagador oscuro
- Desoxirribozima
- Código genético ampliado
- Fluoróforo
- Genética
- Biología Molecular
- Ácido nucleico
- Nucleobase
- Nucleósido
- Nucleótido
- Síntesis de oligonucleótidos
- Ribozima
- Biología sintética
- Xenobiología
- xDNA
- ADN de Hachimoji
- Sistema de información genética ampliado artificialmente (AEGIS)
- Ácido xeno nucleico
Referencias
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