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Construcción de ADN recombinante, en el que se inserta un fragmento de ADN extraño en un vector plasmídico. En este ejemplo, el gen indicado por el color blanco se inactiva tras la inserción del fragmento de ADN extraño.
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Las moléculas de ADN recombinante ( ADNr ) son moléculas de ADN formadas por métodos de laboratorio de recombinación genética (como la clonación molecular ) que reúnen material genético de múltiples fuentes, creando secuencias que de otro modo no se encontrarían en el genoma .

ADN recombinante es el nombre general de un fragmento de ADN que se ha creado combinando al menos dos fragmentos de dos fuentes diferentes. El ADN recombinante es posible porque las moléculas de ADN de todos los organismos comparten la misma estructura química y solo difieren en la secuencia de nucleótidos dentro de esa estructura general idéntica. Las moléculas de ADN recombinante a veces se denominan ADN quimérico , porque pueden estar hechas de material de dos especies diferentes, como la mítica quimera . La tecnología R-DNA utiliza secuencias palindrómicas y conduce a la producción de extremos romos y pegajosos .

Las secuencias de ADN utilizadas en la construcción de moléculas de ADN recombinante pueden proceder de cualquier especie . Por ejemplo, el ADN vegetal se puede unir al ADN bacteriano o el ADN humano se puede unir al ADN fúngico. Además, las secuencias de ADN que no se encuentran en ningún lugar de la naturaleza pueden crearse mediante síntesis química de ADN e incorporarse a moléculas recombinantes. Usando tecnología de ADN recombinante y ADN sintético, literalmente cualquier secuencia de ADN puede crearse e introducirse en cualquiera de una amplia gama de organismos vivos.

Las proteínas que pueden resultar de la expresión de ADN recombinante dentro de las células vivas se denominan proteínas recombinantes . Cuando se introduce ADN recombinante que codifica una proteína en un organismo huésped, la proteína recombinante no se produce necesariamente. [1] La expresión de proteínas extrañas requiere el uso de vectores de expresión especializados y, a menudo, requiere una reestructuración significativa por secuencias codificantes extrañas. [2]

El ADN recombinante se diferencia de la recombinación genética en que el primero es el resultado de métodos artificiales en el tubo de ensayo, mientras que el segundo es un proceso biológico normal que da como resultado la mezcla de secuencias de ADN existentes en prácticamente todos los organismos.

Creación de ADN

Gene cloning.svg

La clonación molecular es el proceso de laboratorio utilizado para crear ADN recombinante. [3] [4] [5] [6] Es uno de los dos métodos más utilizados, junto con la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), que se utiliza para dirigir la replicación de cualquier secuencia de ADN específica elegida por el experimentalista. Hay dos diferencias fundamentales entre los métodos. Una es que la clonación molecular implica la replicación del ADN dentro de una célula viva, mientras que la PCR replica el ADN en el tubo de ensayo, sin células vivas. La otra diferencia es que la clonación implica cortar y pegar secuencias de ADN, mientras que la PCR amplifica copiando una secuencia existente.

La formación de ADN recombinante requiere un vector de clonación , una molécula de ADN que se replica dentro de una célula viva. Los vectores generalmente se derivan de plásmidos o virus y representan segmentos relativamente pequeños de ADN que contienen las señales genéticas necesarias para la replicación, así como elementos adicionales para la conveniencia de insertar ADN extraño, identificar células que contienen ADN recombinante y, cuando sea apropiado, expresar el ADN extraño. La elección del vector para la clonación molecular depende de la elección del organismo huésped, el tamaño del ADN que se va a clonar y si se va a expresar el ADN extraño y de qué manera. [7] Los segmentos de ADN se pueden combinar utilizando una variedad de métodos, como la clonación de enzimas de restricción / ligasa oMontaje de Gibson .

En los protocolos de clonación estándar, la clonación de cualquier fragmento de ADN implica esencialmente siete pasos: (1) Elección del organismo huésped y vector de clonación, (2) Preparación del ADN del vector, (3) Preparación del ADN que se va a clonar, (4) Creación de ADN recombinante, (5) Introducción de ADN recombinante en el organismo huésped, (6) Selección de organismos que contienen ADN recombinante, y (7) Selección de clones con insertos de ADN deseados y propiedades biológicas. [6] Estos pasos se describen con cierto detalle en un artículo relacionado ( clonación molecular ).

Expresión de ADN

Después del trasplante en el organismo huésped, el ADN extraño contenido en la construcción de ADN recombinante puede expresarse o no . Es decir, el ADN puede simplemente replicarse sin expresión, o puede transcribirse y traducirse y se produce una proteína recombinante. En términos generales, la expresión de un gen extraño requiere reestructurar el gen para incluir secuencias que son necesarias para producir una molécula de ARNm que puede ser utilizada por el aparato de traducción del huésped (por ejemplo , promotor , señal de iniciación de la traducción y terminador de la transcripción ). [8]Pueden realizarse cambios específicos en el organismo huésped para mejorar la expresión del gen ectópico. Además, también pueden ser necesarios cambios en las secuencias codificantes para optimizar la traducción, hacer que la proteína sea soluble, dirigir la proteína recombinante a la ubicación celular o extracelular adecuada y estabilizar la proteína frente a la degradación. [9] [10] [11]

Propiedades de los organismos que contienen ADN recombinante

En la mayoría de los casos, los organismos que contienen ADN recombinante tienen fenotipos aparentemente normales . Es decir, su apariencia, comportamiento y metabolismo generalmente no cambian, y la única forma de demostrar la presencia de secuencias recombinantes es examinar el ADN mismo, generalmente usando una prueba de reacción en cadena de la polimerasa (PCR). [12] Existen importantes excepciones, que se analizan a continuación.

Si las secuencias de ADNr codifican un gen que se expresa, entonces se puede detectar la presencia de ARN y / o productos proteicos del gen recombinante, típicamente usando RT-PCR o métodos de hibridación occidental . [12] Los cambios fenotípicos graves no son la norma, a menos que el gen recombinante haya sido elegido y modificado para generar actividad biológica en el organismo huésped. [13] Los fenotipos adicionales que se encuentran incluyen la toxicidad para el organismo huésped inducida por el producto del gen recombinante, especialmente si se sobreexpresa o se expresa en células o tejidos inapropiados.

En algunos casos, el ADN recombinante puede tener efectos perjudiciales incluso si no se expresa. Un mecanismo por el cual esto sucede es la inactivación por inserción , en la que el ADNr se inserta en el gen de la célula huésped. En algunos casos, los investigadores utilizan este fenómeno para " anular " genes y determinar su función e importancia biológica. [14]Otro mecanismo por el cual la inserción del ADNr en el ADN cromosómico puede afectar la expresión génica es mediante la activación inapropiada de genes de la célula huésped no expresados ​​previamente. Esto puede suceder, por ejemplo, cuando un fragmento de ADN recombinante que contiene un promotor activo se localiza junto a un gen de la célula huésped previamente silencioso, o cuando un gen de la célula huésped que funciona para restringir la expresión génica sufre inactivación por inserción por ADN recombinante.

Aplicaciones del ADN

El ADN recombinante se usa ampliamente en biotecnología , medicina e investigación . Hoy en día, las proteínas recombinantes y otros productos que resultan del uso de la tecnología del ADN se encuentran esencialmente en todas las farmacias, consultorios médicos o veterinarios, laboratorios de pruebas médicas y laboratorios de investigación biológica occidentales. Además, los organismos que han sido manipulados utilizando tecnología de ADN recombinante, así como los productos derivados de esos organismos, han llegado a muchas granjas, supermercados , botiquines domésticos e incluso tiendas de mascotas, como las que venden GloFish y otros productos genéticos. animales modificados .

La aplicación más común del ADN recombinante es la investigación básica, en la que la tecnología es importante para la mayoría del trabajo actual en las ciencias biológicas y biomédicas. [12] El ADN recombinante se utiliza para identificar, mapear y secuenciar genes, y para determinar su función. Las sondas de ADNr se emplean para analizar la expresión génica dentro de células individuales y en los tejidos de organismos completos. Las proteínas recombinantes se utilizan ampliamente como reactivos en experimentos de laboratorio y para generar sondas de anticuerpos para examinar la síntesis de proteínas dentro de células y organismos. [4]

Muchas aplicaciones prácticas adicionales del ADN recombinante se encuentran en la industria, la producción de alimentos, la medicina humana y veterinaria, la agricultura y la bioingeniería. [4] A continuación se identifican algunos ejemplos específicos.

Quimosina recombinante
La quimosina, que se encuentra en el cuajo , es una enzima necesaria para fabricar queso. Fue el primer aditivo alimentario modificado genéticamente utilizado comercialmente. Tradicionalmente, los procesadores obtenían quimosina a partir del cuajo, una preparación derivada del cuarto estómago de terneros alimentados con leche. Los científicos diseñaron una cepa no patógena (K-12) de la bacteria E. coli para la producción de laboratorio a gran escala de la enzima. Esta enzima recombinante producida microbiológicamente, idéntica estructuralmente a la enzima derivada de ternera, cuesta menos y se produce en abundantes cantidades. Hoy en día, aproximadamente el 60% del queso duro de EE. UU. Se elabora con quimosina modificada genéticamente. En 1990, la FDA otorgó a la quimosina el estado " generalmente reconocido como seguro " (GRAS) basado en datos que mostraban que la enzima era segura. [15]
Insulina humana recombinante
Reemplazó casi por completo la insulina obtenida de fuentes animales (por ejemplo, porcinos y bovinos) para el tratamiento de la diabetes insulinodependiente . Se utilizan ampliamente una variedad de diferentes preparaciones de insulina recombinante. [16] La insulina recombinante se sintetiza insertando el gen de la insulina humana en E. coli , o levadura (Saccharomyces cerevisiae) [17] que luego produce insulina para uso humano. [18]
Hormona de crecimiento humana recombinante (HGH, somatotropina)
Administrado a pacientes cuyas glándulas pituitarias generan cantidades insuficientes para apoyar el crecimiento y desarrollo normales. Antes de que la HGH recombinante estuviera disponible, la HGH para uso terapéutico se obtenía de las glándulas pituitarias de cadáveres. Esta práctica insegura llevó a algunos pacientes a desarrollar la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob . La HGH recombinante eliminó este problema y ahora se usa terapéuticamente. [19] También se ha utilizado indebidamente como una droga para mejorar el rendimiento por los atletas y otros. [20] Entrada de DrugBank
Factor VIII de coagulación sanguínea recombinante
Proteína de coagulación de la sangre que se administra a pacientes con formas del trastorno hemorrágico hemofilia, que no pueden producir factor VIII en cantidades suficientes para mantener la coagulación sanguínea normal. [21] Antes del desarrollo del factor VIII recombinante, la proteína se obtenía procesando grandes cantidades de sangre humana de múltiples donantes, lo que conllevaba un riesgo muy alto de transmisión de enfermedades infecciosas transmitidas por la sangre , por ejemplo, el VIH y la hepatitis B. Entrada en el DrugBank
Vacuna recombinante contra la hepatitis B
La infección por hepatitis B se controla mediante el uso de una vacuna contra la hepatitis B recombinante, que contiene una forma del antígeno de superficie del virus de la hepatitis B que se produce en las células de levadura. El desarrollo de la vacuna de subunidad recombinante fue un desarrollo importante y necesario porque el virus de la hepatitis B, a diferencia de otros virus comunes como el virus de la polio , no se puede cultivar in vitro . Información sobre vacunas de la Hepatitis B Foundation
Diagnóstico de infección por VIH
Cada uno de los tres métodos ampliamente utilizados para diagnosticar la infección por VIH se ha desarrollado utilizando ADN recombinante. La prueba de anticuerpos ( ELISA o western blot ) utiliza una proteína recombinante del VIH para detectar la presencia de anticuerpos que el cuerpo ha producido en respuesta a una infección por VIH. La prueba de ADN busca la presencia de material genético del VIH mediante la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR). El desarrollo de la prueba de RT-PCR fue posible gracias a la clonación molecular y el análisis de secuencia de los genomas del VIH. Página de pruebas de VIH de los Centros para el Control de Enfermedades (CDC) de EE. UU.
Arroz dorado
Variedad recombinante de arroz que ha sido diseñada para expresar las enzimas responsables de la biosíntesis de β-caroteno . [13] Esta variedad de arroz es muy prometedora para reducir la incidencia de la deficiencia de vitamina A en la población mundial. [22] El arroz dorado no se utiliza actualmente, a la espera de que se resuelvan las cuestiones reglamentarias y de propiedad intelectual [23] .
Cultivos resistentes a herbicidas
Se han desarrollado variedades comerciales de cultivos agrícolas importantes (que incluyen soja, maíz / maíz, sorgo, canola, alfalfa y algodón) que incorporan un gen recombinante que da como resultado resistencia al herbicida glifosato (nombre comercial Roundup ) y simplifica el control de malezas mediante el glifosato. solicitud. [24] Estos cultivos son de uso comercial común en varios países.
Cultivos resistentes a insectos
Bacillus thuringeiensis es una bacteria que produce de forma natural una proteína ( toxina Bt ) con propiedades insecticidas. [22] La bacteria se ha aplicado a los cultivos como una estrategia de control de insectos durante muchos años, y esta práctica se ha adoptado ampliamente en la agricultura y la jardinería. Recientemente, se han desarrollado plantas que expresan una forma recombinante de la proteína bacteriana, que puede controlar eficazmente algunos insectos depredadores. Los problemas ambientales asociados con el uso de estos cultivos transgénicos no se han resuelto por completo. [25]

Historia

La idea del ADN recombinante fue propuesta por primera vez por Peter Lobban, un estudiante de posgrado del Prof. Dale Kaiser en el Departamento de Bioquímica de la Facultad de Medicina de la Universidad de Stanford. [26] Las primeras publicaciones que describen la producción exitosa y la replicación intracelular de ADN recombinante aparecieron en 1972 y 1973, de Stanford y UCSF . [27] [28] [29] [30] En 1980 Paul Berg , profesor del Departamento de Bioquímica de Stanford y autor de uno de los primeros artículos [27] recibió el Premio Nobel de Química por su trabajo sobre ácidos nucleicos "con especial atención al ADN recombinante". Werner Arber, Hamilton Smith y Daniel Nathans compartieron el Premio Nobel de Fisiología o Medicina de 1978 por el descubrimiento de endonucleasas de restricción que mejoraron las técnicas de la tecnología del ADNr.

La Universidad de Stanford solicitó una patente estadounidense sobre ADN recombinante en 1974, y enumeró a los inventores como Herbert W. Boyer (profesor de la Universidad de California, San Francisco ) y Stanley N. Cohen (profesor de la Universidad de Stanford ); esta patente se otorgó en 1980. [31] El primer fármaco con licencia generado utilizando tecnología de ADN recombinante fue la insulina humana, desarrollada por Genentech y con licencia de Eli Lilly and Company . [32]

Controversia

Los científicos asociados con el desarrollo inicial de métodos de ADN recombinante reconocieron que existía la posibilidad de que los organismos que contienen ADN recombinante tuvieran propiedades indeseables o peligrosas. En la Conferencia de Asilomar de 1975 sobre ADN recombinante , se discutieron estas preocupaciones y se inició una moratoria voluntaria sobre la investigación del ADN recombinante para experimentos que se consideraban particularmente riesgosos. Esta moratoria se observó ampliamente hasta que los Institutos Nacionales de Salud(EE. UU.) Elaboró ​​y emitió directrices formales para el trabajo con el ADNr. Hoy en día, las moléculas de ADN recombinante y las proteínas recombinantes generalmente no se consideran peligrosas. Sin embargo, persisten las preocupaciones sobre algunos organismos que expresan ADN recombinante, particularmente cuando salen del laboratorio y se introducen en el medio ambiente o en la cadena alimentaria. Estas preocupaciones se discuten en los artículos sobre organismos modificados genéticamente y controversias sobre alimentos modificados genéticamente . Además, existen preocupaciones sobre los subproductos en la producción biofarmacéutica, donde el ADN recombinante da como resultado productos proteicos específicos. El subproducto principal, denominado proteína de la célula huésped , proviene del sistema de expresión del huésped y representa una amenaza para la salud del paciente y el medio ambiente en general.[33] [34]

Ver también

  • Conferencia Asilomar sobre ADN recombinante
  • Ingeniería genética
  • Organismo genéticamente modificado
  • Virus recombinante
  • ADN vectorial
  • Ingeniería biomolecular
  • Tecnologia de ADN recombinante
  • Proteína de la célula huésped

Referencias

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Lectura adicional

  • El octavo día de la creación: creadores de la revolución en biología . Libros Touchstone, ISBN 0-671-22540-5 . 2da edición: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996 rústica: ISBN 0-87969-478-5 .  
  • Micklas, David. 2003. Ciencia del ADN: un primer curso . Prensa de Cold Spring Harbor: ISBN 978-0-87969-636-8 . 
  • Rasmussen, Nicolas , Gene Jockeys: Life Science and the Rise of Biotech Enterprise , Johns Hopkins University Press, (Baltimore), 2014 . ISBN 978-1-42141-340-2 . 
  • Rosenfeld, Israel. 2010. ADN: una guía gráfica de la molécula que sacudió al mundo . Prensa de la Universidad de Columbia: ISBN 978-0-231-14271-7 . 
  • Schultz, Mark y Zander Cannon. 2009. Las cosas de la vida: una guía gráfica de la genética y el ADN . Hill y Wang: ISBN 0-8090-8947-5 . 
  • Watson, James. 2004. ADN: El secreto de la vida . Casa aleatoria: ISBN 978-0-09-945184-6 . 

Enlaces externos

Recursos de la biblioteca sobre
proteínas recombinantes
  • Recursos en tu biblioteca
  • Recursos en otras bibliotecas
  • Hoja de datos de ADN recombinante (de la Universidad de New Hampshire)
  • Plásmidos en levaduras (hoja informativa de la Universidad Estatal de San Diego)
  • Animación que ilustra la construcción de ADN recombinante y la producción de proteínas extrañas por bacterias recombinantes
  • Investigación de ADN recombinante en UCSF y aplicación comercial en Genentech Transcripción editada de la entrevista de 1994 con Herbert W. Boyer, Proyecto de historia viva. Historia oral.
  • Manual de métodos y principios de purificación de proteínas recombinantes
  • Instituto de Tecnología de Massachusetts, Programa de Historia Oral, Colección de Historia Oral sobre la Controversia del ADN Recombinante , MC-0100. Instituto de Tecnología de Massachusetts, Departamento de Colecciones Distintivas, Cambridge, Massachusetts